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實時熒光定量PCR！！2019/09/18

實時熒光定量PCR一種科學準確的定量方法實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應用。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹。一.實時熒光定量PCR原理所謂實時熒光定量PCR技術(shù)，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。1.Ct

實時熒光定量PCR原理2019/09/18

一、實時熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。（二）實時原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量，無法對擴增反應實時檢測。2、實時定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析3、如何對起始模板定量？通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析.4、幾個概

羊邊界病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒2019/09/18

產(chǎn)品及特點羊邊界病病毒(BorderDiseaseVirus，BDV)會引起羊邊界病，是新生羔羊以身體多毛、生長不良和神經(jīng)異常為主要特征的一種先天性傳染病。邊界病病毒的臨診表現(xiàn)主要取決于宿主的年齡。臨診疾病限于在懷孕期受到感染的新生或年幼羔羊。如一個羊群受到感染時，主要表現(xiàn)在繁殖季節(jié)不孕或流產(chǎn)增多，流產(chǎn)可發(fā)生于懷孕的任何時期，但以懷孕后90天左右為多。由于胎兒的嚴重畸型導致脊柱后側(cè)凸或關(guān)節(jié)變曲而表現(xiàn)為難產(chǎn)。邊界病病毒呈世界性分布，大多數(shù)飼養(yǎng)綿羊國家都有本病的報道，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的

DS堿裂解法（試劑盒提取）提取質(zhì)粒2019/09/17

實驗方法原理堿裂解法是一種應用為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復性的差異而達到分離目的。在pH值高達12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀的兩條互補鏈不會*分離，當以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性時，變性的質(zhì)粒DNA又恢復原來的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA

PCR技術(shù)：反向PCR2019/09/17

描述一種大聚合酶鏈反應(PCR)應用的方法，使在已知序列的核心區(qū)邊側(cè)的未知DNA成幾何級數(shù)擴增。用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切裂解含核心區(qū)的DNA，以產(chǎn)生適合于PCR增大小的片段，然后片段的末端再連接形成環(huán)狀分子。PCR的引物同源于環(huán)上核心區(qū)的末端序列，但其方向性，使鏈的延長經(jīng)過環(huán)上的未知區(qū)而不是分開引物的核心區(qū)。這種反向PCR方法可用于擴增本來就在核心區(qū)旁邊的序列，還可應用于制備未知序列探針或測定邊側(cè)區(qū)域本身的上、下游序列。引言通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位于編碼DNA的上游和下游

PCR試劑盒熒光探針雙標記法2019/09/17

實驗方法原理本實驗用1μg/ml三尖杉酯堿HT在體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)

熒光探針雙標記法檢測細胞凋亡2019/09/17

實驗方法原理本實驗用1μg/ml三尖杉酯堿HT在體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)

2×探針法 qPCR Mix 2×Probe qPCR Mix2019/09/16

產(chǎn)品及特點本產(chǎn)品是基于熒光探針檢測的即用型PCR試劑盒，可以對靶片段進行實時定量PCR分析（quantitativePCR、qPCR）。產(chǎn)品含有經(jīng)過優(yōu)化的緩沖液組分、熱啟動TaqDNA聚合酶、TaqDNA穩(wěn)定劑、dNTPs、MgCl2和穩(wěn)定劑等所有實時定量PCR所需要的成分，用戶只需加入基因組DNA或cDNA模板、引物和探針即可進行探針法實時定量PCR反應，具有廣泛的用途。本產(chǎn)品具有下列特點：1.以2×Mix提供，用戶只需準備模板、引物、探針和ROX染料（取決于qPCR儀器）即可以進行探針法實時

細胞表面標記的檢測技術(shù)活細胞免疫熒光技術(shù)－流式細胞儀標本的制備2019/09/16

實驗方法原理活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結(jié)合，再用熒光標記的第二抗體結(jié)合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。實驗材料抗體血清試劑、試劑盒RPMI1640DPBS洗滌液固定液儀器、耗材玻璃管塑料管離心機顯微鏡實驗步驟1.制備活性高的細胞懸液（培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法）2.用10％FCSRPMI1640調(diào)整細胞濃度為5×106～1×107/ml3.取40μl細胞懸液加入預先有特異性McA

用端粒酶誘導人類間充質(zhì)干細胞永生化實驗2019/09/16

實驗方法原理1.從動物或人組織中提取的細胞，在體外培養(yǎng)中，細胞會有不同程度的分裂增殖，稱為增殖性衰老。但是有些細胞在自發(fā)或其他條件誘導下可突破增殖性衰老，擁有無限增殖的能力，成為永生化細胞，骨髓來源的間充質(zhì)干細胞屬于多能干細胞，可作為組織工程種子細胞的來源。2.端粒酶對染色體的穩(wěn)定性及決定細胞生命周期起極其重要的作用。端粒酶或末端轉(zhuǎn)移酶是由兩個主要的亞單位構(gòu)成：RNA成分（hTR）和蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT），RNA（hTR）亞單位普遍表達于正常和腫瘤組織中，而蛋白質(zhì)分解亞單位（hTERT）

細胞周期測定BrdU滲入法2019/09/16

實驗方法原理細胞周期指細胞一個世代所經(jīng)歷的時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測群體周期。BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復制的原料，經(jīng)過兩個細胞周期后，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一個周期，則兩條單

免疫熒光實驗如何選擇和使用熒光直標一抗，你需要注意這四點！2019/09/12

一、選擇熒光標記要匹配熒光直標抗體的一個主要優(yōu)勢在于它為多重檢測提供了機會，比如現(xiàn)在一些先進的流式細胞儀能檢測每個細胞中20多個離散參數(shù)。在設計多重實驗時，應考慮每種熒光基團的*性質(zhì)，如大吸收波長和大發(fā)射波長，消光系數(shù)和斯托克斯位移等因素。對于免疫熒光分析方法，人們要同時檢測組織或細胞樣本中的多個抗原，常常會利用直標一抗進行免疫熒光共染色，這時一般盡量選擇光譜重疊比較少的熒光基團進行組合。比如，我們會選擇一個AF488標記的抗體和另一個AF647標記的抗體進行兩個不同蛋白的共染色。對于流式細胞分

石蠟切片免疫組化實驗之即用型（Envision）快速酶免疫組化二步法2019/09/12

實驗方法原理根據(jù)聚合酶技術(shù)把辣根過氧化物酶抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在多聚酶上形成多聚物分子,其與待檢的抗原特異性的結(jié)合后，加入底物顯色。實驗材料石蠟切試劑、試劑盒PBS檸檬酸鹽緩沖液蒸餾水增強劑酶標抗鼠兔聚合物蘇木素酒精二甲苯樹膠鹽酸二氨基聯(lián)苯胺儀器、耗材烘箱微波盒塑料切片架顯微鏡膠頭滴管實驗步驟1.石蠟切片置于67℃烘箱中，烘片2小時，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次，每次3分鐘（3×3’）。2.取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中，微波加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片

鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)SP法2019/09/12

實驗方法原理SP（streptavidin-perosidase）法，即鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法。SP法是常使用的方法。試劑、試劑盒二甲苯酒精PBS雙氧水枸櫞酸緩沖液羊血清工作液辣根過氧化物酶鏈霉素卵白素蘇木素DAB儀器、耗材冰箱顯微鏡燒杯玻璃缸實驗步驟1.烤片：68℃，20min。2.常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水：二甲苯I20min?二甲苯II20min?00%酒精10min?100%酒精10min?95%酒精5min?80%酒精5min?70%酒精5min。3.阻斷滅活內(nèi)源性過氧

細胞凋亡之熒光探針雙標記法2019/09/11

實驗方法原理本實驗用1μg/ml三尖杉酯堿HT在體外誘導培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propidiumiodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)

細胞凋亡之形態(tài)學檢測法2019/09/11

實驗方法原理根據(jù)凋亡細胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細胞形態(tài)變化。實驗材料Hela細胞Jurkat細胞試劑、試劑盒DAPIHoechst蒸餾水PBS儀器、耗材光學顯微鏡倒置顯微鏡透射電子顯微鏡熒光顯微鏡共聚焦激光掃描顯微鏡實驗步驟一、光學顯微鏡和倒置顯微鏡1.未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。2.染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體

細胞凋亡之Annexin V/PI雙染色法2019/09/11

實驗方法原理細胞凋亡早期改變發(fā)生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在于細胞膜的內(nèi)面，在細胞發(fā)生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。AnnexinV是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白，初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，AnnexinV具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露

植物細胞色素C氧化酶（COX）ELISA試劑盒2019/09/11

本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫(yī)學診斷植物細胞色素C氧化酶（COX）ELISA試劑盒使用說明書檢測原理試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被細胞色素C氧化酶（COX）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞色素C氧化酶（COX）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。樣品收集、處理及

植物交替氧化酶（AOX）ELISA試劑盒2019/09/11

本試劑盒只能用于科學研究，不得用于醫(yī)學診斷植物（Plant）交替氧化酶（AOX）ELISA檢測試劑盒使用說明書檢測原理試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被交替氧化酶（AOX）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的交替氧化酶（AOX）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品含量。樣品收集、處理及

細胞原代培養(yǎng)實驗之組織塊直接培養(yǎng)法2019/09/10

實驗材料孕鼠新生小鼠試劑、試劑盒RPMI1640培養(yǎng)基牛血清胰蛋白酶Hanks液酒精青霉素鏈霉素儀器、耗材培養(yǎng)瓶青霉素瓶廢液缸血球計數(shù)板蠟盤手術(shù)器械大頭針離心管小玻璃漏斗三角燒瓶平皿吸管試管移液管無菌紗布無菌眼科剪實驗步驟一、將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中。二、用Hank's液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。三、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1