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含甲酰胺的測序膠2021/12/15

原理聚丙烯酰胺凝膠加人甲酰胺可以使造成條帶壓縮的測序產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。材料與儀器DNA甲酰胺甲醇乙醇TEMEDSDS電泳儀步驟1.按基本方案步驟1~5組裝凝膠平板夾層。2.按所需濃度配制甲酰胺凝膠溶液，加熱輕輕挽拌使之溶解，冷卻至30℃以下。3.加入0.15mlTEMED及1ml10%過硫酸銨，馬上灌膠于凝膠平板夾層，觀察聚合情況。4.在45~70W恒功率下電泳。5.按基本方案步驟19~33進(jìn)行干膠及處理，但步驟18在5%乙酸/20%甲醇固定液中固定凝膠15min。同實驗其他方法變性凝膠電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠的制備實驗2021/12/15

材料與儀器丙烯酰胺溶液過硫酸銨水溶液去離子水去污劑乙醇KOH甲醇溶液聚硅氧烷溶液TBE電泳緩沖液TEMED尿素彈簧夾干膠架封膠帶膠板（配對的）和隔板手套凡士林保護(hù)性的工作合紙鯊魚齒梳子有臂的燒瓶隔板注射器試管架步驟材料緩沖液和溶液參照附錄1配制貯存液、緩沖液、試劑。稀釋貯存液到適當(dāng)?shù)臐舛取１０啡芤海?5%m/V）丙烯酰胺（DNA測序級）434gN,N'-亞甲雙丙烯酰胺16g加水至600ml加熱至37°C以促進(jìn)溶解用蒸餾水調(diào)至1升，用硝酸纖維素膜過濾（孔徑0.45ptn).室溫貯存于棕色瓶中。

原位裂解細(xì)胞的CAT分析法2021/12/15

材料與儀器轉(zhuǎn)染細(xì)胞Triton裂解液培養(yǎng)皿培養(yǎng)箱步驟1.60mm培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，用2mlPBS洗1次。每培養(yǎng)皿加入2ml低滲緩沖液，在室溫下溫育2~5min。2.吸去低滲緩沖液，加入400μlTriton裂解液。用橡膠刮子將細(xì)胞刮離培養(yǎng)血，用1000μl移液器將裂解物移入1.5ml微量離心管中。3.微量離心1min除去細(xì)胞核，不可溶性蛋白。將上清轉(zhuǎn)入一個干凈的微量離心管中，進(jìn)行CAT活性分析。同實驗其他方法CAT活性的層析分析法1.100mm培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的貼

緩沖液梯度測序膠2021/12/15

原理在本實驗方案，測序膠底部的緩沖液濃度大于其頂部濃度，使得短寡核苷酸片段（膠底部）的遷移率相對比長寡核苷酸（頂部）的遷移率要慢一些，這洋凝膠可電泳更長的時間而不至于短核苷醆從底部走失并改善了長核苷酸鏈的分離度。材料與儀器DNATEMEDSDSTBE燒杯電泳儀步驟1.按基本方案步驟1~5組裝凝膠平板夾層。2.在2個100ml燒杯中，配制緩沖液梯度凝膠溶液：50ml用0.5×TBE配制，25ml用2.5×TBE配制，在50℃以下加熱至固體*溶解，冷卻至室溫，加人20μlTEMED和200μl10%

CAT活性的層析分析法2021/12/14

材料與儀器DNAPBS乙酸乙酯氯仿甲醇Tris·Cl薄層層析缸濾紙離心管離心機(jī)步驟1.100mm培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染了CAT表達(dá)質(zhì)粒的貼壁細(xì)胞，用PBS洗兩次，每次5ml每培養(yǎng)皿加入1mlTEN溶液。將細(xì)胞置于冰浴5min。2.用橡膠細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來，將其轉(zhuǎn)入一只1.5ml的微量離心管中，置于冰浴5min。3.在4℃以最大離心速度離心細(xì)狍1min，細(xì)胞沉淀重懸于100μl冰冷的0.25mol/l的pH7.5的Tris·Cl緩沖液中。4.在干冰/乙醇中凍結(jié)細(xì)胞5min，移至37℃融解5mi

哺乳動物細(xì)胞基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的實驗2021/12/14

材料與儀器哺乳動物細(xì)胞*培養(yǎng)液培養(yǎng)箱離心管步驟1.確定所要轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系能呈獨(dú)立集落生長。對于貼壁細(xì)胞，在10cm組織培養(yǎng)培養(yǎng)皿中接種約100個細(xì)胞，培養(yǎng)10~12天，毎4天換液1次。亞甲藍(lán)染色后對成活的細(xì)胞集落進(jìn)行計數(shù)。2.確定母代細(xì)胞的選擇條件：將一培養(yǎng)皿上生長匯片的細(xì)胞按不小于1：15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10天。用合適的選擇培養(yǎng)液每4天換液1次，并檢查活細(xì)胞。3.確定轉(zhuǎn)染母代細(xì)胞的*的方法?？蛇x用磷酸鈣或電穿孔方法。對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染，在加DNA的前1天，將母代細(xì)胞按1：

變性凝膠電泳實驗2021/12/14

材料與儀器DNA乙醇異丙醇二甲基二氯硅烷TEMED變性丙烯酰胺溶液SDS電泳儀注射器巴斯德吸管干膠機(jī)步驟1.制作每塊凝膠時，首先要用肥皂及水小心嚴(yán)格地清洗兩塊30cm×40cm的前后玻璃平板，用去離子水沖洗后晾干，用噴射洗瓶噴10%乙酵或異丙醇使平板濕海。2.然后用Kimwipe紙或其他無絨紙巾將平板擦干。3.戴手套在通風(fēng)櫥工作，用浸濕了含5%二甲基二氯硅烷的氯仿溶液的Kimwipe紙在每片平板的其中一面加一層此溶液，并小心洗擦拭整面平板。4.待硅化層干后，用Kimwipe紙以70%

哺乳動物中制備基因組 DNA 實驗2021/12/14

材料與儀器動物組織PBS乙酸銨乙醇酚氯仿異戊醇TE離心機(jī)搖床研缽步驟1.切下組織并立即剪成小塊，置于液氮中凍結(jié)。2.將200mg~1g的組織用預(yù)冷的研缽和研杵研碎，或用錘子將其搗為細(xì)粉末，每100mg組織用1.2ml消化緩沖液懸浮。3.500g離心細(xì)胞5min，棄上請。貼壁生長細(xì)胞先用胰酶消化。4.細(xì)胞用1~10ml冰冷的PBS重懸，500g離心5min，棄上清，重復(fù)1次。5.用1體積的消化緩沖液重懸細(xì)胞。6.將樣品在蓋緊的管中于50℃搖蕩下溫育12~18h。7.用等體積的酚/氯仿/異戊酵抽提樣

小鼠皮脂腺的油紅染色實驗步驟2021/12/12

材料與儀器器材：棕色可密封瓶、研缽、漏斗、定性濾紙、冷凍切片等試劑：①油紅染料（稱取預(yù)先研磨粉碎的0.5g油紅干粉，溶于少量異丙醇中，然后加異丙醇至100ml，棕色瓶密封（或錫箔紙包裹避光）4℃保存，為儲存液，可長期保存。用時油紅工作液需現(xiàn)配：取6ml加三蒸水4ml混勻，定性濾紙過濾，稀釋后數(shù)小時內(nèi)用完）②異丙醇步驟小鼠皮脂腺的油紅染色實驗的基本過程可分為如下幾步：1.將冷凍切片從冰箱中取出，晾干。2.用PBS洗3次，每次5分鐘。3.用4％多聚甲醛固定5～10分鐘。4.用蒸餾水洗兩遍，每次5分鐘

小鼠皮膚冷凍包埋實驗步驟2021/12/12

簡介對皮膚的冷凍切片進(jìn)行油紅0染色可以分析皮脂腺的油脂分泌功能和皮下脂肪層的形態(tài)，常用于小鼠皮膚炎癥及皮脂腺相關(guān)研究。材料與儀器器材：液氮、鋁箔、解剖工具、小鼠等試劑：①多聚甲醛（Sigma-Aldrich）②冷凍包埋劑步驟小鼠皮膚冷凍包埋實驗的基本過程可分為如下幾步：A.對小鼠處以安樂后，從背部剪下方形皮膚組織，將該皮膚貼到干凈的濾紙上，用至少20倍體積的4％多聚甲醛固定過夜（20小時，＜24小時）。注意：把皮膚貼到濾紙上時，用鑷子輕輕把皮膚展開，既不要留下皺褶，也不要太用力拉扯而使組織結(jié)構(gòu)變

美國Biozellen®基質(zhì)膠在小鼠皮下成瘤實驗中的應(yīng)用2021/12/12

3D細(xì)胞培養(yǎng)，因為傳統(tǒng)2D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境方面做得還不夠，3D細(xì)胞培養(yǎng)就是為了在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為細(xì)胞提供一個更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境。而在3D細(xì)胞培養(yǎng)中，3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠作為基礎(chǔ)的試劑，至為重要。而目前多大都為動物源的基質(zhì)膠，存在一定的人畜共患病的病原菌或毒素污染的風(fēng)險，今天小編給大家分享一款植物源的3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠和它在小鼠皮下成瘤實驗中的應(yīng)用。美國Biozellen®基質(zhì)膠在小鼠皮下成瘤實驗中的應(yīng)用一、應(yīng)用?3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗?小鼠皮下成瘤?細(xì)胞遷移實驗?適合用

美國Biozellen®基質(zhì)膠在細(xì)胞遷移實驗中的應(yīng)用2021/12/12

3D細(xì)胞培養(yǎng)簡介：傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境方面做得還不夠。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)明就是為了在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為細(xì)胞提供一個更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境。而在3D細(xì)胞培養(yǎng)中，3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠作為3D細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)試劑，至為重要。而目前多大都為動物源的基質(zhì)膠，存在一定的人畜共患病的病原菌或毒素污染的風(fēng)險，今天小編給大家分享一款植物源的3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠和它在細(xì)胞遷移實驗中的應(yīng)用。美國Biozellen®基質(zhì)膠在細(xì)胞遷移實驗中的應(yīng)用一、應(yīng)用?3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗?小鼠皮下成瘤?細(xì)胞遷移實

美國Biozellen®基質(zhì)膠在細(xì)胞3D成球?qū)嶒炛械膽?yīng)用2021/12/12

3D細(xì)胞培養(yǎng)簡介：傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在模擬細(xì)胞體內(nèi)生存環(huán)境方面做得還不夠。3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)明就是為了在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，為細(xì)胞提供一個更加接近體內(nèi)生存條件的微環(huán)境。而在3D細(xì)胞培養(yǎng)中，3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠作為基礎(chǔ)的試劑，至為重要。而目前多大都為動物源的基質(zhì)膠，存在一定的人畜共患病的病原菌或毒素污染的風(fēng)險，今天小編給大家分享一款植物源的3D細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)膠和它在細(xì)胞3D成球?qū)嶒炛械膽?yīng)用一、應(yīng)用?3D細(xì)胞球體培養(yǎng)試驗?小鼠皮下成瘤?細(xì)胞遷移實驗?適合用于3D細(xì)胞藥物篩檢平臺?細(xì)胞生長和分化?代謝/毒理學(xué)

如何運(yùn)用生物化學(xué)方法檢測細(xì)胞凋亡？2021/12/10

早期凋亡細(xì)胞及活細(xì)胞的胞膜正常，DNA染料碘化丙錠(PI)拒染，但可被另外一種DNA染料Hoechst342(Ho342)染色；而壞死細(xì)胞的胞膜完整性受到破壞，細(xì)胞不需固定即可被PI染色。凋亡細(xì)胞的胞膜成分亦發(fā)生改變，在凋亡早期，原來位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(PS)遷移至脂雙層外側(cè)。另外，細(xì)胞凋亡時核酸內(nèi)切酶被激活，首先將DNA切成50～300kb大小的DNA，然后進(jìn)一步將染色質(zhì)裂解成單個核小體和寡聚核小體，形成180～200bp的DNA的片斷。而壞死細(xì)胞DNA斷裂無規(guī)律性。本期小編帶來細(xì)胞

如何保證siRNA能夠成功的轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中？2021/12/10

siRNA轉(zhuǎn)染和干擾效果不佳的問題。要保證RNA干擾的效果就必須保證siRNA能夠成功的轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中去，那有時候會轉(zhuǎn)染不進(jìn)去，原因可能有如下幾點(diǎn)：1、轉(zhuǎn)染方法：轉(zhuǎn)染siRNA濃度太低。FAM驗證轉(zhuǎn)染效率時siRNA(FAM)的量的終濃度是50-150nM都可以，需要根據(jù)細(xì)胞進(jìn)行摸索。lipo2000的量和使用的siRNA量成比例的，一般用1:1的效果好一些。建議用24孔板摸索條件。siRNA所加的量及其濃度可以根據(jù)實驗自己調(diào)整，按照要求配成20uM的濃度，那1ul就是20pmol,在1ml細(xì)胞培

細(xì)胞增殖與毒性檢測實驗方法及經(jīng)驗總結(jié)-CCK8法2021/12/10

實驗原理：CellCountingKit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。一、用途

細(xì)胞自噬的實驗方法詳解2021/12/10

自噬（autophagy）被認(rèn)為是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過程，也是對等壓力源的反應(yīng)，如營養(yǎng)缺乏，這可能會危及細(xì)胞的生存。當(dāng)細(xì)胞接觸到這些壓力源時，原本在低水平發(fā)生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就會被大幅度上調(diào)。這種上調(diào)會增加了細(xì)胞的吸收和降解，將大分子釋放回胞質(zhì)中以驅(qū)動必須的代謝反應(yīng)并產(chǎn)生能量。在正常和壓力條件下，自噬對細(xì)胞健康的貢獻(xiàn)，意味著這種嚴(yán)格調(diào)控和精確協(xié)調(diào)過程的重要生理和病理作用。事實上，自噬在哺乳動物的發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)是有用的。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬是各種疾病和病癥的重要調(diào)節(jié)器。探索自

細(xì)胞培養(yǎng)室這5個地方該如何清潔？2021/12/10

細(xì)胞培養(yǎng)室的滅菌與消毒細(xì)胞培養(yǎng)對無菌環(huán)境的要求較為嚴(yán)格。稍有不慎細(xì)胞全軍覆沒，損失慘重。為此保持細(xì)胞室的無菌環(huán)境尤為重要。細(xì)胞培養(yǎng)間的殺菌主要涉及空氣的殺菌和操作臺，培養(yǎng)箱的滅菌，其常見的方法如下。一、細(xì)胞房常規(guī)操作規(guī)范1、每天使用細(xì)胞房前需提前將層流室及緩沖間紫外燈打開照射30min。2、紫外滅菌消毒結(jié)束后通風(fēng)15min，實驗人員方可進(jìn)入細(xì)胞房工作。3、進(jìn)入細(xì)胞房前先換專用鞋。4、進(jìn)入緩沖間穿換上專用實驗服。5、進(jìn)入層流室須戴上手套、口罩，消毒后才可以進(jìn)行實驗。6、每間層流室內(nèi)最多可4個人使用

解答流式細(xì)胞凋亡檢測疑難2021/12/09

1、Q：rhAnnexinVR-PE20tests是BD公司用于凋亡流式檢測的試劑盒，產(chǎn)品顯示種屬為人，請問能否用于大鼠細(xì)胞的檢測？A：可以。因為AnnexinV是與PS親和，而PS在不同種屬間應(yīng)該沒差異。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種分子量為35~36kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。

細(xì)胞培養(yǎng)常見問題及解答（三）2021/12/09

本期分享第三期的細(xì)胞培養(yǎng)常見問題的內(nèi)容，希望對大家有所幫助啦~20.如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理？原則上：直接滅菌后丟棄之。當(dāng)重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細(xì)菌、真菌、支原體或酵母，把污染細(xì)胞與其它細(xì)胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細(xì)胞系有毒性，因而，做劑量反應(yīng)實驗確定抗生素和抗霉菌素產(chǎn)生毒性的劑量水平。這點(diǎn)在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性