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細胞培養技術2021/10/29

簡介一.細胞培養的基本原理細胞培養是用酶消化法將組織碎塊分離成單個細胞，用培養基制成細胞懸液，在體外適宜條件下，使細胞生長繁殖，并保留其一定的結構和功能特性。細胞培養與組織培養、器官培養主要不同點在于原始培養的對象不同。細胞培養使用的是單個細胞懸液，組織培養使用的是組織塊(0．5～1立方毫米)或薄片(厚0．2毫米)，而器官培養使用的是器官原基或器官的一部分或整個器官。在組織培養中，細胞自組織塊周圍移出并生長，細胞在生長過程中總有移動(運動)或其它變動，這樣就使被培養的組織難以長期維持其原有的結構

MDCK細胞培養2021/10/29

簡介一、目的MDCK細胞培養是分離流感病毒及相關研究實驗的基本技術。疾控中心的所有技術人員，必須按照本文件相關的操作規程進行操作。二、適用范圍適用于疾控中心所有技術人員。三、程序（一）生物安全要求實驗室生物安全級別：BSL-1所有操作必須在BSL-1實驗室的生物安全柜里進行。材料與儀器二）材料1.生長成片的MDCK細胞2.無菌的T25細胞培養瓶3.D-MEM培養液（含有L-谷氨酰胺）4.青、鏈霉素母液（10000U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸鏈霉素），分裝后保存于-20℃5.HEPE

病原微生物提取的方法有哪些？2021/10/26

數據統計據WHO統計，全球感染性疾病導致的患者死亡占全部死因的25%以上，在中國，感染性疾病占所有疾病的50%以上，75%造血系統腫瘤患者和50%實體腫瘤患者死于感染，膿毒癥（嚴重感染）患者病死率高達50%。而在面對疑難重癥時，快速檢測病原微生物變得刻不容緩。什么是病原微生物病原微生物是指侵犯入人體引起感染的微生物，或稱病原體。病原微生物包括病毒、細菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體等。mNGS就是綜合分析來自患者樣本的病原微生物的基因物質（DNA和RNA），實現病原種屬

雙重染色法免疫熒光組織化學染色步驟2021/10/26

材料與儀器：原代培養胚胎14天大鼠端腦細胞，FITC，TRITC實驗步驟：雙重染色法免疫熒光組織化學染色步驟若在同一標本中有兩A和B種抗原需要同時顯示，A抗原的抗體用FITC標記，B抗原的抗體用TRITC標記，可采用以下染色方法：免疫熒光細胞化學雙重染魚法原代培養胚胎14天大鼠端腦細胞：在骨發生形態蛋白―{誘導下，乙酰膽堿轉移酶(呈綠色熒光)和同源域蛋白Islet―1(呈紅色熒光)共存于細胞質內(激光掃描共聚焦顯微鏡觀察)1．一步雙染色法先將兩種熒光標{己抗體按適當比例混合(A+B)，按直接法進

免疫熒光（Immunofluorescence, IF）實驗方法2021/10/26

材料與儀器：免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。實驗步驟：免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，

免疫熒光技術-間接法2021/10/26

材料與儀器：抗體PBS伊文氏蘭顯微鏡實驗步驟：1.標本固定后，PBS洗滌3x3分鐘；2.滴加一抗，37℃40分鐘或4℃過夜；3.PBS洗3x3分鐘；4.滴加熒光標記二抗37℃，40分鐘；5.PBS洗3x3分鐘；6.0.1%伊文氏蘭復染；7.PBS洗3x3分鐘；8.緩沖甘油封片，鏡檢。要點：1.種屬在進行雙重免疫標記時，要選擇來源于兩種不同種屬動物的一抗，如選擇來源于rabbit和mouse的抗體，二抗則用帶有不同熒光素標記的，如抗rabbit或抗mouse二抗，FITC和Tex-Red;2.孵育

免疫熒光技術-直接法2021/10/26

材料與儀器：抗體PBS伊文氏蘭顯微鏡實驗步驟：1.標本經固定后，PBS洗滌3×3分鐘；2.加熒光素標記的抗體，濕盒內37℃孵育50分鐘；3.PBS洗滌3×3分鐘；4.0.1%伊文氏蘭復染；5.PBS洗3次，蒸餾水洗2次，每次3分鐘，以除去NaCl結晶；6.緩沖甘油封片，鏡檢。要點：直接法比較簡單，特異性也較高，但每種熒光抗體只能檢測一種相應的抗原，應用范圍較窄，敏感性也較低。對實驗結果的觀察、判斷與分析是影響實驗結果的重要環節，判斷結果的好與壞、真與假需注意以下幾點。1、必須設立對照染色（陰性或

冰凍切片和石蠟切片各自的優劣之處是什么？2021/10/26

冰凍切片和石蠟切片各自的優劣之處1、從一抗的選擇方面來看。有的一抗既能做石蠟切片又能做冰凍切片，而有的一抗只能做冰凍切片，關鍵取決于所要檢測的抗原穩定性，有的抗原不穩定，經過組織固定，脫水、透明、浸蠟、包埋、脫蠟等一系列的做石蠟切片的步驟，所檢測的抗原易被破壞，這時只能用冰凍切片來做，檢測這類抗原的一抗只能做冰凍切片，而那些穩定的抗原，能經受住石蠟切片的的考驗，一般來講也可以用冰凍切片來做，總得來講，對于既可以用冰凍切片也可以用石蠟切片檢測的抗原，用石蠟切片檢測的染色效果要比冰凍切片好一些。2、

細胞不長，這些方面您注意了嗎？2021/10/25

Q1培養液pH對細胞生長的影響？答：由于大多數細胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此范圍可能對細胞生長將產生有害的影響，目前也有些無血清培養基或者轉染用的培養基PH值會在6.5左右。因為各種細胞對pH的要求也不*相同，原代培養細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐堿性強一些。在配制培養用液時，需要注意一點：培新配的培養基在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右Q2培養液pH下降很快可能原因有哪些？其解決方法是什么？答：通常細胞生

NGS建庫人都在用的文庫質量評定方法，你都知道嗎？2021/10/25

高通量測序（NextGenerationSequencing，NGS）近年來飛速發展，在各個領域已被廣泛應用。而文庫的制備是NGS技術中極為重要的步驟。所謂文庫制備（LibraryPreparation）就是在DNA的片段兩端連接上特定序列的接頭的過程，讓文庫可以在高通量測序平臺上進行測序。文庫構建的最終目的在于成功測序，并獲得序列信息。那么如何判定這個文庫能否上機測序呢？想必這是大家一致關注的問題。文庫的數量和質量是能否成功測序的關鍵。文庫的濃度和文庫分布是評價文庫質量的兩個關鍵參數。文庫濃度

常見的DNA損傷類型有哪些？2021/10/25

說起DNA損傷修復，相信大家都很熟悉，但小編今日還是要跟大家再嘮嘮這個話題，講講在二代建庫中，如果DNA存在損傷，那常見的損傷類型有哪些呢？而這些損傷又是如何進行修復的呢？損傷的形成常見的DNA損傷有兩種，一種是由DNA復制中的錯誤或DNA自發性的化學變化引起的自發性損傷，一種是由物理或化學等外界環境因素引起的被動性損傷。這些損傷如果發生在活體中，會由機體進行自發性修復，但如果損傷嚴重，不能*修復，長時間則會引起機體老化或腫瘤等疾病的發生。在建庫過程中，我們遇到的DNA損傷多為外界環境引起的被動

化學感受態細胞進行質粒DNA轉化的原理2021/10/25

背景介紹將質粒DNA轉化入細菌的過程稱為轉化。轉化通常有兩種方法：化學轉化法和電穿孔法。電穿孔法的轉化率高達109～1010個轉化子/μg質粒DNA，轉化率比化學轉化法高，當可能得到的每一個克隆都非常重要時（如構建cDNA文庫），就需要用電穿孔法。化學轉化法一般每微克DNA能獲得105～106個轉化子，可滿足常規的克隆實驗需求，因此化學轉化法在克隆實驗中是較為常用到的轉化方法。化學感受態細胞轉化步驟化學轉化法中用到的感受態細胞是化學感受態細胞，化學感受態細胞常用冰預冷的CaCl2處理細菌的方法來

ELISA雙抗體夾心法2021/10/22

簡介ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。受檢標本與固相載體表面的抗原或抗體起反應。材料與儀器（1）包被緩沖液（pH9.60.05M碳酸鹽緩沖液）（2）洗滌緩沖液（pH7.4，0.15MPBS）（3）稀釋液（4）終止液（2MH2SO4）（5）底物緩沖液（pH5.0）（6）四甲基聯苯胺（TMB）使用液（7）2，2’-連氮基-雙-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺（ABTS）使用液（8）

蛋白質免疫印跡實驗方法原理步驟及注意事項2021/10/22

蛋白質免疫印跡（WesternBlot|WB）實驗方法原理步驟及注意事項一：蛋白提取1、組織蛋白提取1）所需器材：制冰機、標記筆、兩套1.5mlEP管（最好高溫高壓處理）、一個大冰盒、一個1.5mlEP管盒、手套、眼科剪（最好高溫高壓處理）、新鮮組織或保存于-80℃冰箱組織、保存于4℃冰箱的PBS（最好高溫高壓處理）、移液槍、吸頭（最好高溫高壓處理）、兩套研磨棒（最好高溫高壓處理）、掌上離心機、濾紙、三去污裂解液、苯甲基磺酸氟（PMSF，一種蛋白酶抑制劑，劇毒）、離心機、燒杯、2×SDS凝膠上樣

非基因組DNA的提取2021/10/22

一、DNA提取方法簡介1、基因組DNA的提取1.1、CTAB法1.2、SDS法1.3、其它2、非基因組DNA的提取2.1、質粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法2.1.2、煮沸法2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結合SDS裂解法2、非基因組DNA的提取2.1、質粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法l堿裂解法原理染色體DNA比質粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質粒DNA為共價閉合環狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發生變性，共價閉環的質粒DNA在回到中性pH時

DNA提取方法簡介2021/10/22

一、DNA提取方法簡介1、基因組DNA的提取1.1、CTAB法1.2、SDS法1.3、其它2、非基因組DNA的提取2.1、質粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法2.1.2、煮沸法2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取差速離心結合SDS裂解法1、基因組DNA的提取1.2、SDS法SDS法原理SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（55～65℃）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰浴），使蛋白質及多糖雜質沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/

核酸提取的方法2021/10/22

核酸是遺傳信息的載體，是最重要的生物信息分子，是分子生物學研究的主要對象，因此核酸的提取是分子生物學實驗技術中最重要、最基本的操作。核酸提取系列目錄一、DNA提取方法簡介二、DNA提取常見問題、原因分析及其對策三、RNA提取方法簡介四、RNA提取及其RT-PCR常見問題、原因分析及其對策一、DNA提取方法簡介1、基因組DNA的提取1.1、CTAB法1.2、SDS法1.3、其它2、非基因組DNA的提取2.1、質粒DNA的提取2.1.1、堿裂解法2.1.2、煮沸法2.2、線粒體、葉綠體DNA的提取差

Southern Blot DNA印跡雜交實驗全流程2021/10/21

一、DNA的提取人和哺乳動物細胞基因組DNA的分離通常是在有EDTA、Sarkosye等一類去污劑存在下，用蛋白酶K消化細胞，隨后用FEN、LVFANG抽提，經RNase處理和純化來提取DNA。(1)取單層細胞，經無鈣、鎂PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，細胞懸液經PBS洗2次,棄上清，取細胞沉淀。(2)加入2ml細胞裂解液(10mMTrisHCL，pH8.0，0.1mol/LEDTA，10mmol/LNaCL，1%SDS)充分混勻，加入蛋白酶K至終濃度為0.5～1g/L、Sarkosye

如何確定實驗室常用試劑的有效期？2021/10/21

試劑的有效日期是影響實驗結果準確性的重要因素。在實際使用過程中，人們總是習慣于用生產日期來判斷化學試劑的有效性，其實這是不對的。化學試劑不像食品和藥品有嚴格的保質期，化學試劑一般沒有保質期的具體要求和界限，這與化學試劑的保質期受多方面因素影響有關。要根據化學性質、保存條件等，再結合工作的實際情況判斷試劑是否出現變質、能否繼續使用。化學試劑一般沒有注明保質期，確定試劑是否變質主要是憑經驗和做新舊試劑對比試驗。化學試劑的有效期隨著化學品的化學性質的改變，有著很大的區別。一般情況下，化學性質穩定的物質

帶你走近細胞生物學世界的第一步——細胞培養2021/10/21

細胞培養的概念：細胞培養（cellculture）是指在體外模擬體內環境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規名詞為細胞培養技術。細胞培養技術可以由一個細胞經過大量培養成為簡單的單細胞或極少分化的多細胞，通過細胞培養既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。細胞培養所需的儀器設備：倒置顯微鏡便于掌握細胞的生長情況（細胞形態、大小、密度、結構）并觀察有無污染