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TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法2018/08/20: 細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca2和Mg2依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞

噬菌體的檢查及效價(jià)測定2018/08/20: 1、目的：1.1了解噬菌體效價(jià)的含義及其測定原理。1.2學(xué)會(huì)檢查噬菌體的方法。1.3掌握用雙層瓊脂平板法測定噬菌體效價(jià)的操作技能。2、原理：噬菌體是一類專性寄生于細(xì)菌和放線菌等微生物的病毒，其個(gè)體形態(tài)極其微小，用常規(guī)微生物計(jì)數(shù)法無法測得其數(shù)量。當(dāng)烈性噬菌體侵染細(xì)菌后會(huì)迅速引起敏感細(xì)菌裂解，釋放出大量子代噬菌體，然后它們?cè)贁U(kuò)散和侵染周圍細(xì)胞，終使含有敏感菌的懸液由混濁逐漸變清，或在含有敏感細(xì)菌的平板上出現(xiàn)肉眼可見的空斑──噬菌斑。了解噬菌體的特性，快速檢查、分離，并進(jìn)行效價(jià)測定，對(duì)在生產(chǎn)和科研工作

蛋白質(zhì)提取與純化技術(shù)2018/08/14: 以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識(shí)生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整

細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的特點(diǎn)及檢驗(yàn)的筆記2018/08/14: 近看大家常提到支原體污染，就翻了翻書，做了些筆記，現(xiàn)在貼出來和大家分享：支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間(小直徑0．2um)并獨(dú)立生活的微生物。約有1%可通過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁形態(tài)呈高度多形性。可為圓形、絲狀或梨形。支原體形態(tài)多變，在光境下不易看清內(nèi)部結(jié)構(gòu)。電鏡下觀察支原體膜為三層結(jié)構(gòu)。其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群或中央束。支原體代謝需固醇類物質(zhì)、部分種類需要精氨酸、

NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解作用的研究2018/08/10: 前言自然殺傷細(xì)胞(NatureKillerCells,NK)是骨髓衍化的淋巴細(xì)胞，其初通過巨大的顆粒性狀被識(shí)別。NK細(xì)胞能自發(fā)殺滅多種腫瘤細(xì)胞，同時(shí)還可保護(hù)正常的細(xì)胞，從而被認(rèn)為是癌癥的克星。重要的是，不管是在胞內(nèi)還是胞外，NK細(xì)胞不需要免疫接種或提前激活，就能夠自發(fā)溶解特定的腫瘤靶細(xì)胞，而T細(xì)胞必須要通過抗原遞呈細(xì)胞的協(xié)助才能發(fā)揮作用。許多胞內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)表明,除了外滲出和滲入腫瘤組織的能力外，NK細(xì)胞還有望具有抗腫瘤的能力。研究發(fā)現(xiàn)缺失NK細(xì)胞的小鼠在致癌物誘下更容易發(fā)產(chǎn)生癌癥。另外，缺乏NK細(xì)

活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例2018/08/10: 活體成像中熒光色素標(biāo)記細(xì)胞的方法舉例活體光學(xué)成像(OpticalinvivoImaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）技術(shù)與熒光（fluorescence）技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，今天，生物發(fā)光標(biāo)記物可以標(biāo)記到任何一種基因上，使對(duì)基因功能的全面細(xì)致研究成為現(xiàn)實(shí)。而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)（GFP、RFP,Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記，利用熒光蛋白在外源光源或是內(nèi)源發(fā)光照射下被激發(fā)產(chǎn)生的熒光作為檢測信號(hào)。研究人員能夠利用一套

一氧化氮（NO）信號(hào)通路研究2018/08/10: 一氧化氮（NO）信號(hào)通路研究一氧化氮合酶（NOS）抑制劑研究背景：一氧化氮（NO）是自分泌和旁分泌的信號(hào)通路分子，可以擴(kuò)散進(jìn)入生物膜。發(fā)揮作用時(shí)間很短（幾秒鐘），主要的生理功能是促進(jìn)血管動(dòng)態(tài)平衡。它能夠抑制平滑肌收縮生長，阻止血小板凝聚以及防止白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附。另外它還參與免疫防御系統(tǒng)，神經(jīng)傳遞，血管生成等過程。NO的下游靶標(biāo)包括鳥苷酸環(huán)化酶和NF-κB，前者可以提高cGMP水平，后者在iNOS基因表達(dá)作為重要的轉(zhuǎn)錄因子。體內(nèi)NO水平和信號(hào)失調(diào)常發(fā)生于某些疾病狀態(tài)。糖尿病病人具有低于的NO水

小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF培養(yǎng)相關(guān)知識(shí)總結(jié)2018/08/09: 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的富集1、給13-14天的孕鼠注射大約0.5ml阿佛丁。當(dāng)鼠麻醉后，實(shí)施斷頸法處死小鼠。2、用70％乙醇擦拭腹部，把皮膚向后拉，暴露出腹膜。用消毒過的工具，剪開腹壁以暴露出子宮角。將子宮角移到10cm的皿里。用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。3、用剪刀剪開每一測的胚囊,并將胚胎移到培養(yǎng)皿中。4、用兩副鐘表鑷子將胎盤和膜與胚胎分離開，分離后切除內(nèi)臟（所有深色的東西）。將胚胎轉(zhuǎn)移到(有蓋)培養(yǎng)皿中，用10ml不含鈣鎂離子的PBS洗三遍。5、用帶有彎鉤的眼科剪將組織剪碎，當(dāng)你剪的

考馬斯藍(lán)染色法原理2018/08/09: 相關(guān)專題Bradford法檢測蛋白濃度專題考馬斯亮藍(lán)法也稱考馬斯藍(lán)染色法(coomassiebluestaining)又稱Bradford法。由于其突出的優(yōu)點(diǎn)，正得到越來越廣泛的應(yīng)用。考馬斯亮藍(lán)G-250(CoomassiebrilliantblueG-250)測定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，大光吸收在488nm;當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長下有大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測定。蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-25

小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運(yùn)動(dòng)能力檢測與結(jié)構(gòu)觀察實(shí)驗(yàn)2018/08/09: 本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖钦莆招∈蟛G丸、附睪及輸精管精子采集方法；掌握血球計(jì)數(shù)板法精子計(jì)數(shù)和運(yùn)動(dòng)能力檢測的方法；通過睪丸、附睪及輸精管精子運(yùn)動(dòng)能力檢測，認(rèn)識(shí)精子在睪丸產(chǎn)生后，在附睪內(nèi)成熟的過程；掌握精子抹片方法；掌握染色法進(jìn)行精子結(jié)構(gòu)觀察和頂體結(jié)構(gòu)觀察的方法，認(rèn)識(shí)精子的正常結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)方法原理哺乳動(dòng)物的精子形成后必須經(jīng)過在附睪內(nèi)發(fā)生一系列形態(tài)、生理和生化方面的變化而終達(dá)到成熟后，才能獲得向前運(yùn)動(dòng)的能力，這種向前運(yùn)動(dòng)是精子受精能力的重要指標(biāo)。哺乳動(dòng)物精子包括頭部和尾部二個(gè)主要部分，頸部介于頭部和尾部之間，形成頭部

殺傷細(xì)胞功能的檢測實(shí)驗(yàn)2018/08/09: 殺傷功能是機(jī)體免疫功能的一個(gè)重要方面，免疫系統(tǒng)中有多種具有殺傷功能的靶細(xì)胞，如自然殺傷細(xì)胞（NK）、細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）、具有ADCC作用的單核細(xì)胞巨噬細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)方法原理NK細(xì)胞存在于人或動(dòng)物外周血、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染靶細(xì)胞，無需抗原或有絲分裂原刺激，也不依賴抗體或補(bǔ)體，在機(jī)體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。LAK是NK或T細(xì)胞在體外高劑量IL-2誘導(dǎo)下，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細(xì)胞的功能，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用。通過將同位素51Cr

原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)檢測凋亡2018/08/08: （一）原理凋亡細(xì)胞是由于內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活后，將DNA切割成許多雙鏈DNA段以及高分子量DNA單鏈斷裂點(diǎn)（缺口），暴露出大量3-羥基末端，如用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）將標(biāo)記的dUTP進(jìn)行缺口末端標(biāo)記，則可原位特異地顯示出凋亡細(xì)胞。主要應(yīng)用的是熒光標(biāo)記法和酶標(biāo)記法。（二）熒光標(biāo)記法1．材料與試劑采用德國Boehringer-Mannheim公司InSituCellDeathDetection試劑盒，或美國Oncor公司ApopTagTM試劑盒，包括：⑴生物素標(biāo)記的-Dutp(Biotin

檢測細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)方法比較2018/08/08: TUNEL與ELISA檢測凋亡的方法比較TUNEL法細(xì)胞凋亡中,染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正

多酚氧化酶（PPO）的分離提取2018/08/07: 一、原理與目的多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機(jī)械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質(zhì)對(duì)微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會(huì)提高。多酚氧化酶也可與細(xì)胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子

細(xì)胞裂解液的制備2018/08/07: 一、試劑準(zhǔn)備1、新鮮配制冷的RIPA裂解緩沖液:150mMNaCL1%NP-40(去垢劑)0.1%SDS(去垢劑)2ug/mlAprotinin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)2ug/mlLeupeptin(蛋白酶抑制劑)(使用前加入)1mMPMSF(蛋白酶抑制劑)1.5mMEDTA(蛋白酶抑制劑)1mMNaVanadate(磷酸脂酶抑制劑)(任選)以上所有試劑均按比例溶于150mMNaCL溶液中。2、冷的PBS中加入1mMPMSF1.5mMEDTA1mMNaVanadate（釩酸鈉）(任選)3、

蛋白質(zhì)提取的好辦法2018/08/07: 你試一試這兩種方法:種：1）將細(xì)胞系放在冰上2）去除上清，用pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次3）加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min4)刮下單層細(xì)胞，4度下10000g5min離心5）溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后37度下2000g離心5min6)收集水相留作分析7）用500ul冰冷的bufferC溶解去污劑相沉淀，冰浴2min后加溫，在按步驟6再次離心8）按步驟8再次抽提去污劑相，用bufferC將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積9）用等量的bufferA

蛋白樣品的定量2018/08/07: 目前常用比色法測定樣品蛋白的含量：Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）、Lowry法（Folin-酚試劑法）、BCA法等。但各有優(yōu)缺點(diǎn)，大家可以根據(jù)具體情況選取。按相應(yīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大，大家可以根據(jù)具體情況選取。Bradford法（考馬斯亮藍(lán)法）:考馬斯亮藍(lán)G-250

放射免疫分析法的建立2018/08/06: 一、放射免疫分析的基本試劑（一）標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品是放射免疫分析法定量的依據(jù)，由于以標(biāo)準(zhǔn)品的量用來表示被涮物質(zhì)的量，故標(biāo)準(zhǔn)品與被測物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)。應(yīng)要求高度純化。標(biāo)準(zhǔn)品除含量應(yīng)具有準(zhǔn)確性外，還應(yīng)具備穩(wěn)定性，即在合理的貯存條件下保持原來的特性。按實(shí)驗(yàn)要求，將標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成含不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。（二）標(biāo)記物標(biāo)記抗原應(yīng)具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長，標(biāo)記一次可較長時(shí)間使用，這對(duì)來之不易的抗

原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系2018/08/02: 原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系細(xì)胞的來源多樣，培養(yǎng)方法也各不相同，凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長傳至10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開展單細(xì)胞克隆、純化，經(jīng)大量擴(kuò)增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群，稱之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞。此過程稱為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ)，只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和

無血清培養(yǎng)基2018/08/02: 無血清培養(yǎng)基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時(shí)間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子；又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。無血清培養(yǎng)基的基本配方:

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