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miRNA 成熟過程中的關(guān)鍵性酶和蛋白2023/06/27: RNApolymeraseII：一般認(rèn)為miRNA基因由RNApolymeraseII轉(zhuǎn)錄而來。可將miRNA基因轉(zhuǎn)錄成5'端蓋帽m7G和3‘端加尾polyA結(jié)構(gòu)。Drosha：Drosha蛋白為RNaseIIIenzyme家族中的成員之一，主要作用就是剪切Pri-miRNA成為具有3‘端2nt懸垂的pre-miRNA。DGCR8：是第一個(gè)被鑒定出來的參與了體內(nèi)miRNA加工過程的Pasha蛋白，參與了Drosha蛋白對底物的識別。Exportin5：為核轉(zhuǎn)運(yùn)受體家族的一個(gè)成員，其作用過程通過核

lncRNA 的生物學(xué)功能（二）2023/06/27: 一）lncRNA對于細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報(bào)道，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的方式，來影響細(xì)胞的增殖。例如，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞內(nèi)大量集聚。其發(fā)揮作用的機(jī)制是抑制對于糖皮質(zhì)激素敏感的基因表達(dá)，使得細(xì)胞發(fā)生凋亡。Gas5能與糖皮質(zhì)激素受體上的“糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件”（glucocorticoidresponseelement，GRE，該反應(yīng)元件位于糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)）相結(jié)合，通過競爭性抑制的方式抑

lncRNA 的生物學(xué)功能（一）2023/05/17: （一）lncRNA對于細(xì)胞周期及凋亡的調(diào)控作用有研究報(bào)道，lncRNA可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡的方式，來影響細(xì)胞的增殖。例如，Gas5（growtharrest-specific5，非編碼RNA）在細(xì)胞周期阻滯的細(xì)胞內(nèi)大量集聚。其發(fā)揮作用的機(jī)制是抑制對于糖皮質(zhì)激素敏感的基因表達(dá)，使得細(xì)胞發(fā)生凋亡。Gas5能與糖皮質(zhì)激素受體上的“糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件”（glucocorticoidresponseelement，GRE，該反應(yīng)元件位于糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域內(nèi)）相結(jié)合，通過競爭性抑制的方式

構(gòu)建載體2023/05/05: 構(gòu)建載體最關(guān)鍵的一步就是設(shè)計(jì)引物引入酶切位點(diǎn)，一旦引物設(shè)計(jì)好，那接下來就非常簡單了，今天重點(diǎn)就來教教大家如何利用snapgene輕松獲得構(gòu)建載體所需的引物序列。1.打開軟件，選擇第一個(gè)（紅線標(biāo)記），然后輸入基因的CCDS序列（基因的CCDS序列可在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得）。2.點(diǎn)擊ok后界面，圖中顯示的是會切割基因編碼序列的酶3.接下來點(diǎn)擊最上面的EnzymesNoncutters，會顯示所有不會切割基因編碼序列的酶，這些酶都是我們可以用的，選酶的標(biāo)準(zhǔn)：要選擇不能切割目的基因序列并且質(zhì)粒上含有的酶

引物設(shè)計(jì)原則2023/05/05: 1）擴(kuò)增產(chǎn)物長度100bp-150bp為佳；2）引物長度17bp-25bp最好；3）正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超過1℃。Tm值調(diào)整至60℃-65℃為佳；4）引物的GC含量控制在40%-60%之間，最佳為45%-55%；5）引物3'末端堿基最好為G或C或A，避免使用T；6）避開引物內(nèi)部或者兩條引物之間有3個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列，二條引物之間的3'端避開有2個(gè)堿基以上的互補(bǔ)序列；7）引物A、G、C、T整體分布盡量要均勻，避免使用GC或者TA含量高的區(qū)域，尤其是3'端，必須避開GC含量不均勻

PCR 操作中必知的 6 大細(xì)節(jié)2023/05/05: 1、最好使用一次性進(jìn)口tip頭，以避免液體殘留；同時(shí)，tip頭不要長時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。2、加樣時(shí)，tip頭要伸入PCR反應(yīng)管的液面下一點(diǎn)，然后將液體緩緩打入液面下，至恰好打出一個(gè)小氣泡為至；加樣過程最好在冰塊上操作；移液槍用完之后要?dú)w到最大計(jì)量的位置，防止久而久之彈簧失去彈性，而導(dǎo)致加樣量的不準(zhǔn)確。3、配制反應(yīng)體系時(shí)，若反應(yīng)物為凍結(jié)制品，需在融解后上下顛倒輕輕均勻混合；加入試劑之前，把它混勻一下，以免放置時(shí)間長了濃度不均；按照液體體積由大到小的順序?qū)⒎磻?yīng)物加入到PCR管中；引物

PCR 引物設(shè)計(jì)2023/05/05: 好的引物會讓PCR實(shí)驗(yàn)成功一半，因而，引物設(shè)計(jì)一直都是PCR非常重要的環(huán)節(jié)。經(jīng)典之法就是讓Premier5攜手oligo，共同設(shè)計(jì)PCR引物。1、以小鼠的IL-17為例，進(jìn)入NCBI界面,選擇Nucleotide后，輸入IL-17，點(diǎn)擊search。然后選擇人類IL-17的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，選定目的序列。2、打開PrimerPremier5軟件，點(diǎn)擊菜單欄File|New|DNASequence，在出現(xiàn)的對話框里黏貼目的序列，并在paste對話

PCR 產(chǎn)物純化2023/04/21: 材料與儀器TE或去離子水PCR產(chǎn)物離心機(jī)和轉(zhuǎn)子PCR濾件微量離心管步驟一、材料1.緩沖液和溶液TE(lOmmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH7.5)或去離子水2.核酸和寡核苷酸待測序的PCR產(chǎn)物3.離心機(jī)和轉(zhuǎn)子帶有固定傾角轉(zhuǎn)子的小型離心機(jī)，如Eppemlorf5415C4.特殊設(shè)備AmiconMicrocon-PCR濾件（Millipore)或者相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品，微董離心管或接收管二、方法1.對每一個(gè)待純化的PCR產(chǎn)物，都在接收管中放置一個(gè)濾件，濾件的儲液面向上儲液池中加入400

DNA 污染的柱上去除2023/04/21: 材料與儀器DNA酶I緩沖液DNA酶I細(xì)胞裂解液步驟一、材料1.酶和酶緩沖液DNA酶I，擴(kuò)增級（無RNA酶）DNA酶I緩沖液，10X2.細(xì)胞和組織利用總RNA純化試劑盒（例如Madigen總RNA快速純化系統(tǒng)）獲得的細(xì)胞裂解液。二、方法1.將裂解液上到總RNA純化試劑盒（例如Marligen總RNA快速純化系統(tǒng)）所帶的離心套柱上。2.將裂解液上到RNA純化膜上之后，將50ul含5UDNA酶I、在1XDNA酶I緩沖液中的DNA酶I溶液加到每個(gè)離心套柱中。3.室溫下溫育15min。4.于方案6中二、方

冷凍組織及切片的準(zhǔn)備2023/04/21: 材料與儀器1、新鮮的組織2、丙酮蒸餾水干冰磷酸鹽緩沖液（PBS)TekOCT組織復(fù)合物3、封閉容器燒杯恒冷裝置解剖工具平盤組織模子載玻片刀片步驟一、材料1.緩沖液、溶液和試劑丙酮蒸餾水干冰磷酸鹽緩沖液（PBS)TekOCT組織復(fù)合物（SakuraFinetekUSA，Torrance，CA)2.特殊設(shè)備封閉容器燒杯恒冷裝置解剖工具平盤可以削去的一次性組織模子（PelcoInternational，Redding，CA)普通的無粘片劑的載玻片Sakura刀片（IMEB，SanMarcos，CA)3

單鏈 cDNA 的合成2023/04/21: 材料與儀器步驟一、材料1.緩沖液、溶液和試劑去除RNA酶的雙蒸水10XRT-PCR緩沖液（去除RNA酶的雙蒸水，100mmol/LTris-HCl、pH8.3，500mmol/LKC1,15mmol/LMgCl2)2.酶和酶緩沖液MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶（100~200U/ul)SUPERaseINRNA酶抑制劑（20U/ul;Ambion)3.核酸和寡核苷酸dNTP混合物（10mmol/L，包含所有四種dNTP)隨機(jī)引物（5umol/L)總RNA(達(dá)到2.5ug)4.實(shí)驗(yàn)器材薄壁的PCR管二、方法1.

從有限的細(xì)胞中提取 RNA2023/04/21: 材料與儀器LCM帽子乙醇糖原RNA提取試劑盒超純水移液器步驟一、材料1.緩沖液、試劑和溶液75%乙醇(超純水配制）糖原，5mg/ml(Ambion，Austin，TX)StratageneRNA提取試劑盒（200345，StratageneCloningSystems，LaJolla,CA)，包括變性溶液、飽和酚(存于4°C)、β-巰基乙醇(存于4°C)、氯仿：異戊醇、2mol/L乙酸鈉、異丙醇。或者使用PicoPureRNA分離試劑盒（KIT0202，Arcturus，MountainView

細(xì)胞融合的方法及誘導(dǎo)物2023/04/19: 同種細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)2個(gè)靠在一起的細(xì)胞自發(fā)合并，稱自發(fā)融合;異種間的細(xì)胞必須經(jīng)誘導(dǎo)劑處理才能融合，稱誘發(fā)融合。仙臺病毒法融合①兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4℃條件下病毒附著在細(xì)胞膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚;②在37℃中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時(shí)需要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2;②細(xì)胞膜連接部穿通，周邊連接部修復(fù)，此時(shí)需Ca2+和ATP;④融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP。聚乙二醇(PEG)法聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C(CH20CH2)nCH2OH，分子量大于2

大腸桿菌質(zhì)粒DNA的提取2023/04/19: 實(shí)驗(yàn)方法原理堿法提取主要是利用共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒與線性染色質(zhì)在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離它們。在堿性pH環(huán)境，DNA變性，當(dāng)恢復(fù)中性并在高鹽離子濃度時(shí)，絕大多數(shù)質(zhì)粒DNA可以準(zhǔn)確復(fù)性，留在上清中；而線性染色體DNA不能準(zhǔn)確復(fù)性，相互交聯(lián)纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上與蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。離心后獲得大量質(zhì)粒的上清液，利用親水性有機(jī)溶劑（乙醇、異丙醇、PEG8000）使質(zhì)粒DNA脫水，離心后收集。實(shí)驗(yàn)材料含質(zhì)粒的大腸桿菌試劑、試劑盒葡萄糖EDTATris-HClNaOHSDSKAc異戊醇儀器、耗材臺式高速離心機(jī)恒溫振蕩

蛋白酶活性檢測方法2023/04/19: 1定義1g固體酶粉(或1mL液體酶)，在一定溫度和PH值條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個(gè)酶活力單位，以(u/mL)表示。2福林法(第一法)2、1原理蛋白酶在一琿的溫度與PH條件下，水解底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在堿性條件下，將福林試劑(Folin)還原，生成鉬藍(lán)與鎢藍(lán)，用分光度法測定，計(jì)算其酶活力。2、2試劑和溶液2、2、1福林試劑的制備于2000mL磨口回流裝置中加入鎢酸鈉(Na2Wo4·2H2O)100g、鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)25g、水7

植物蛋白質(zhì)組學(xué)和糖基化2023/04/19: 1.前言與其他真核細(xì)胞一樣，植物細(xì)胞中，糖基化通常發(fā)生在分泌蛋白質(zhì)上，雖然在細(xì)胞質(zhì)蛋白和核蛋白上也發(fā)現(xiàn)一些糖基化反應(yīng)。根據(jù)寡糖部分和蛋白質(zhì)骨架之間的連接方式，可將糖基化分為兩種類型：N-糖基化和O-糖基化。植物中N-糖基化研究最多。1.1N-糖基化與其他真核細(xì)胞一樣，在植物細(xì)胞中，N-糖基化只發(fā)生在進(jìn)入分泌途徑的蛋白質(zhì)上。它從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的寡聚糖前體Glc3Man9GlcNAC2共翻譯轉(zhuǎn)移到構(gòu)成初生蛋白質(zhì)(Asn-X-Ser/Thr，X可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一種氨基酸）N--糖基化序列的

標(biāo)記抗體的應(yīng)用技術(shù)2023/04/12: 原理ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、牽9體的特異性反應(yīng)與酶對底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)。由于抗原、抗體的反應(yīng)在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應(yīng)物，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。在實(shí)際應(yīng)用中，通過不同的設(shè)計(jì)，具體的方法步驟可有多種。即：用于檢測抗體的間接法、用于檢測抗原的雙抗體夾心法以及用于檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。材料與儀器B

B 淋巴細(xì)胞膜表面免疫球蛋白的檢查2023/04/12: 原理SmIg是B細(xì)胞的抗原識別受體，也是B細(xì)胞特異的表面標(biāo)志，用直接免疫熒光法可檢查出SmIg。用熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體，在一定條件下與淋巴細(xì)胞混合，熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體可以與B細(xì)胞表面的Ig結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察可見B細(xì)胞膜上出現(xiàn)熒光。此方法可用來鑒定B淋巴細(xì)胞。材料與儀器ICR小鼠異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的兔抗小鼠Ig抗體Hank's液臺式離心機(jī)離心管吸管移液管步驟1.采用頸椎脫臼法處死小鼠，解剖取出脾臟放入盛有6mlHank's液的平皿中，用100目鋼網(wǎng)研磨，混勻。從中吸取1ml

兔多克隆抗血清的制備2023/04/12: 材料與儀器抗原PBS乙醇注射針頭注射器培養(yǎng)箱步驟1.取2ml的弗氏完-全佐劑加到2ml的溶于PBS的純化抗原中，使之乳化。用3ml注射器抽取此乳化液，接上22G注射針頭，排出注射器中的氣泡。2.將兔子敢在固定架上，用一只手抓住兔的頸背部毛皮，另一只手托住兔的后腿及臀部，將兔束緊固定以使后肢不能伸張，用70%乙醇對所要注射的區(qū)域進(jìn)行清潔消毒，在后肢大腿肌肉內(nèi)進(jìn)針約1cm深，毎條大腿肌肉內(nèi)最多注射0.5ml乳化液。3.四周后，用1mg的混溶干弗氏不完-全佐劑的抗原乳化液（1：1）對兔進(jìn)行肌肉內(nèi)加強(qiáng)免

怎么培養(yǎng)好你的細(xì)胞2023/04/11: 細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞和分子生物學(xué)的主要工具之一，提供研究細(xì)胞正常生理學(xué)和生物化學(xué)的優(yōu)秀模型系統(tǒng)（例如，代謝研究、衰老）、藥物和有毒化合物對細(xì)胞的影響，突變和致癌。它還用于藥物篩選和開發(fā)，以及大規(guī)模生產(chǎn)生物化合物（如疫苗、治療性藥物）蛋白質(zhì)）。在這些應(yīng)用中使用細(xì)胞培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是通過使用一批試驗(yàn)獲得的結(jié)果的一致性和再現(xiàn)性克隆細(xì)胞。培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)最重要的組成部分，因?yàn)樗鼮榧?xì)胞生長提供必要的營養(yǎng)、生長因子和激素，以及調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH值和滲透壓。雖然最初的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)是使用從組織提取物和體液中獲得的天然培養(yǎng)

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