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細胞勻漿的操作2021/11/24

材料與儀器細胞緩沖鹽溶液二異丙基氟瞬酸勻漿緩沖液相差顯微鏡步驟1.準備下面的貯液和材料。等滲的緩沖鹽溶液（例如PBS，150mmol/LNaCl；10mmol/LNaPO4，pH7.2)二異丙基氟瞬酸（DIFP）1mol/L咪唑-HCl，pH7.00.5mmol/LK+EGTA，pH7.00.1mol/LK+ATP，pH7.00.1mol/LDTTNaN3蛋白酶抑制劑PMSF抑胃酶肽A亮抑酶肽刀豆胰蛋白酶抑制劑勻漿緩沖液：0.34mol/L蔗糖20mmol/L咪唑-HCl，pH7.05mmoI/

從培養的細胞中純化總RNA的方法2021/11/24

材料與儀器細胞RNA提取緩沖液變性液水飽和酚培養皿Falcon2063管步驟1.取1個細胞已長滿的100ml培養皿，吸出培養液，加2mlRNA提取緩沖液，用橡膠刮棒刮下細胞。RNA提取緩沖液：變性液，20mlβ-巰基乙醇，0.144ml2mol/L乙酸鈉，pH4，2ml水飽和酚，22ml可避光保存在4℃2~3個月。變性液：4mol/L硫氰酸胍：250g硫氰酸胍25mmol/L檸檬酸鈉：17.6ml0.75mol/L檸檬酸鈉，pH70.5%十二烷基肌氨酸鈉（Sarkoayl）：26.4ml10%十

純化質粒（堿裂解法）2021/11/18

材料與儀器大腸桿菌LB葡萄糖緩沖液乙酸鉀離心管步驟1.單個大腸桿菌克隆接種到2ml含適當抗生素的LB中。37℃劇烈振蕩孵育5~8小時?；蛘呖梢耘囵B過夜使飽和。2.倒1.5ml培養液到已作標記的微量離心管中。把剩下的培養液存放在4℃。3.在微量離心機上離心2分鐘以沉淀大腸桿菌。吸掉培養液。4.用100ul葡萄糖緩沖液重懸沉淀物。在室溫孵育5分鐘。在這時候充分懸浮大腸桿菌對于獲得盡可能大的產量是很重要的。葡萄糖緩沖液（配500ml）50mmol/L葡萄糖4.5g葡萄糖10mmol/LEDTA，pH8

基因組DNA的快速純化方法2021/11/18

材料與儀器尾部緩沖液蛋白酶K離心管玻璃棒步驟第1天1.大約1.5cm長的尾部活檢樣品放在一個1.5ml盛有0.7ml尾部緩沖液的小離心管中，加35ul10mg/ml蛋白酶K，在55℃振搖溫育過夜。尾部緩沖液（配25ml）50mmol/LTris，pH81.25ml1mol/LTris，pH8100mmol/LEDTA，pH85ml0.5mol/LEDTA，pH8100mmol/LNaCI0.5ml5mol/LNaCI1%SDS1.25ml20%SDS存放于室溫。蛋白酶K：10mg/ml水溶液，貯

如何從哺乳動物細胞或組織分離DNA2021/11/18

材料與儀器細胞TBS抽提緩沖液離心管步驟1.根據樣品類型，從下列方法中選一個作為步驟1進行操作。(1)細胞樣品①單層培養的細胞以用冰預冷的TBS將單層細胞洗滌2次，用刮棒把細胞刮入約0.5ml的TBS中，將細胞懸液轉移到冰浴的離心管中，用1mlTBS沖洗培養皿，并入離心管中的細胞懸液。于4℃以1500g離心10分鐘以收獲細胞。用5~10倍體積經冰預冷的TBS重懸細胞并再度離心。用TE(pH8.0）重懸細胞，使細胞密度為5x107細胞/ml，轉移至一個三角燒瓶中（1ml細胞懸液用50ml燒瓶；2m

如何從組織中分離制備細胞核基質/中間纖維支架結構？2021/11/18

材料與儀器新鮮組織NaCl緩沖液細胞骨架緩沖液Teflon研杵Doume勻漿器步驟1.在4℃將新鮮組織切成1mm3左右的小塊。在4℃，用Teflon研杵和Doume勻漿器在含0.5%TritronX-100的細胞骨架緩沖液中對切碎的組織進行勻漿，直到沒有可見的團塊。每克組織用大約10ml緩沖液。含0.5%TritonX-100的細胞骨架緩沖液：10mmol/LPIPES，pH6.8300mmoI/L蔗糖100mmoI/LNaCI3mmol/LMgCl21mmol/LEGTA2.用一250μm孔徑

如何從培養細胞中制備細胞核基質/中間纖維骨架結構？2021/11/18

材料與儀器細胞TritronX-100抽提緩沖液電子顯微鏡步驟1.在4℃用PBS洗細胞一次。2.在4℃用含0.5%TritronX-100的細胞骨架緩沖液抽提細胞3到5分鐘。直到消化步驟，每107個細胞最少要用1ml緩沖液，以后減半。3.在4℃用抽提緩沖液抽提細胞3~5分鐘。這一步去除組蛋白H1和除中間纖維蛋白之外的細胞骨架蛋白。另外，這一步也可在DNA酶消化步驟（第4步）之后作，這樣也不會引起超微結構的變化。抽提緩沖液：10mmol/LPIPES，pH6.8250mmol/L硫酸銨300mmo

如何從肝臟組織中制備細胞核？2021/11/17

材料與儀器大鼠裂解緩沖液濃蔗糖溶液超速離心機組織研磨器步驟1.配制裂解緩沖液和濃蔗糖溶液（PMSF在使用前添加），冰上放置。裂解緩沖液：0.25mol/L蔗糖網織紅細胞標準緩沖液（RSB）0.25mol/L蔗糖（超級純）10mmol/Tris-HCl(pH7.4)10mmol/LNaCl3mmol/LMgCl21mmol/LDTT0.5mmol/LPMSF(用前從溶于乙醇的100mmol/L貯存液中添加）濃蔗糖溶液：2mol/L蔗糖RSB2mol/L蔗糖（超級純）10mmol/LTris-HCl

如何從擬南芥菜中分離葉綠體？2021/11/17

材料與儀器葉組織研磨懸浮緩沖液燒杯Polytron勻漿器步驟1.組織勻漿(1)收集10g葉組織，放進一400ml的燒杯中。(2)加入200ml冰冷的研磨懸浮緩沖液。在4℃的房間中，用Polytron勻漿器進行6~7個3秒鐘脈沖勻漿葉組織。研磨重懸緩沖液：10mmol/LEDTA50mmol/LHEPES-KOH，pH8.00.33mol/L甘露醇0.5g/LBSA(無脂肪酸）5mmol/L抗壞血酸鹽（用前添加）(3)用網層米拉布（Calbiochem)過濾勻漿，濾液倒進4個50ml離心管中。2.

葉綠體分離的操作方法2021/11/17

材料與儀器葉子組織PBF-Percoll溶液山梨醇BSAHEPES-KOHEDTA聚碳酸酯離心管步驟1.制備Percoll梯度(1)兩個50ml的聚碳酸酯離心管中分別加入25ml50%的PBF-Percoll溶液。50%PBF-Percoll0.33mol/L山梨醇50mmol/LHEPES-KOH，pH8.02mmol/LEDTA1mmol/LMgCl21mmol/LMnCI250%Percoll(v/v)3%PEG6000(w/v)1%BSA(無脂肪酸，比如Sigma的A7030）1%Fic

從組織培養細胞中制備粗微體的方法2021/11/17

材料與儀器細胞環己酰亞胺勻漿緩沖液培養皿步驟1.培養基中加入環己酰亞胺（溶于蒸餾水，貯存液濃度0.1mol/L，-20℃保存。如果不溶，試著加熱到40℃以幫助溶解）（終濃度10μmol/L)，37℃保溫5~10分鐘。2.培養皿從37℃轉移到冷室，立即去掉培養基，用含有與培養基同樣環己酰亞胺濃度的冰冷PBS洗滌細胞3次，將培養皿口朝下倒立于紙巾上數分鐘，偶爾拍打。用Kimwipe紙巾擦掉側壁上殘留的PBS。3.加入0.7ml含有2~4單位/mlRNase-IN(BoehringerMannheim

從狗的胰臟中制備粗微體2021/11/17

材料與儀器胰臟HM緩沖液蔗糖-緩沖液三乙基氨基乙酸緩沖液步驟1.從動物身體切下胰臟，立即用大約50ml冷HM緩沖液沖洗，放置于干凈的紙巾上，去除結締組織：勻漿介質（HM）0.25mol/L蔗糖-緩沖液A緩沖液A：50mmol/L三乙基氨基乙酸緩沖液（TEA），pH7.550mmol/LKOAc6mmol/LMg(0Ac)21mmol/LEDTA0.5mmol/LPMSF貯存液：1mol/L三乙醇氨緩沖液，pH7.54mol/LKOAc，pH7.51mol/LMg(OAc)2PMSF：100mmo

從大鼠肝臟制備微體的方法2021/11/16

材料與儀器雄大鼠蔗糖蔗糖HM玻璃板步驟1.用斷頸法殺死約150g重的雄大鼠，大鼠的數量取決于要制備的粗微體的數量。由于一個150g重的大鼠肝（6g）大約每克肝蛋白含有10mg粗微體，所以大鼠的數量可以以回收率為50%來進行估計。2.流干血液后，打開腹部和胸腔，切取肝，將它們放在盛有冰冷勻漿介質的燒杯中：勻漿介質（HM）：0.5mol/L蔗糖1mmol/LDTT3.用冰冷HM沖洗大鼠肝，將它們放在紙巾上，如果有結締組織去掉之，迅速稱重。4.將肝放在干凈的玻璃板上，用剃須刀片將其切成盡可能小的碎片，

從海星的無脊椎動物系統獲取配子的實驗2021/11/16

材料與儀器海星（米青）子懸液海水巴斯德吸管步驟1.選擇帶有凸起臂的動物，這些動物是具有配子的成熟動物。2.小心地將巴斯德吸管插入接近中央板的臂內，就會獲得一些配子，這樣也分辨出動物的性別，并且對動物的損害最小。3.從雌性獲取卵巢：從中央板取下臂并解剖開該臂，用鑷子將卵巢取出，握住卵巢使輸卵管閉合，用海水沖洗，之后轉移到一盤海水中。4.5~10分鐘后，取出卵巢，卵子應已釋放出來，使其沉積下來，倒掉海水并加入潔凈的海水。5.從雄性獲?。浊啵┳樱簭男坌院Ｐ堑脑摫壑腥〕霾G丸，用潔凈的海水沖洗。6.取一

從海膽和沙幣等無脊椎動物系統獲取配子的實驗方法2021/11/16

材料與儀器海膽和沙幣KCl溶液3-氨基-124-三唑巴斯德吸管Nytex濾器步驟一、海膽和沙幣體腔內注射0.5mol/L的KCl1.制備0.5mol/L的KCl溶液。2.用海水沖洗一下動物以去掉顆粒物質。3.用一個23~26號的針頭向動物的口緣空腔內注射多達500μl或100μlKCl。4.用巴斯德吸管收集“干”（米青）子，并儲存于置于冰上的小塑料管中?！?.將雌性動物在一杯海水中翻過來收集卵子。6.用Nytex濾器洗卵子，以去掉顆粒，并使卵子吸附到濾膜上。7.通過將水吸走或小心倒掉，再加入潔凈

成年大鼠心室肌肉細胞的分離和培養實驗方法步驟2021/11/16

材料與儀器鼠KH緩沖液混合氣體對流工作臺或層流式超凈臺乙（酉迷）罩冷凝器循環水浴和水浴搖床圈型架蠕動泵臺式醫用離心機無菌燒杯ColorpHastpH試紙步驟一、ARVM細胞分離的準備工作1.準備如下設備及器材：對流工作臺或層流式超凈臺乙（酉迷）罩冷凝器循環水浴和水浴搖床帶夾的圈型架免蠕動泵臺式醫用離心機95%O25%CO2混合氣體400ml無菌燒杯ColorpHastpH試紙（精密型）2.在對流式或層流式工作臺中，裝配Langedorff系統，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動泵。

成纖維細胞的分離方法2021/11/16

步驟1)胚胎的分離。適用哺乳動物（倉鼠、小鼠和大鼠）a.采用認可的方案處死嚙齒動物。b.立即在無菌超凈臺內用70%乙醇擦洗整個動物。若可能，置紫外燈下照射5分鐘。c.用無菌的鑷了和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用無菌鑷子將皮膚扯向后腿。d.用另一無菌的剪刀和鑷子切開腹部，取出含有胚胎的子宮，置于無菌的培蕎皿上。e.剔除胚胎周圍的包膜，將胚胎放于無菌的含有無菌PBS的燒瓶中。f.漂洗胚胎，去掉PBS。繼續用PBS漂洗胚胎直至清洗液清亮為止。適用雞胚胎a.用70%乙醇擦洗雞蛋殼。b.用無菌剪刀輕敲雞

成骨細胞原代培養實驗步驟2021/11/15

材料與儀器骨標本HamsF12培養液用于細胞傳代的胰蛋白酶液分離成骨細胞的消化液Petri培養皿培養瓶手術刀手術鑷步驟一、外植塊培養1.從手術室獲得骨標本。2.在室溫條件下，用無菌生理鹽水浸洗骨組織數次。3.如果骨組織不能及時使用，將骨標本放入含有12%FBS、青霉素和硫酸鏈霉素的Ham’sF12（添加12%FBS、2.3mmol/LMg2＋、100U/ml青霉素和100ug/ml硫酸鏈霉素）培養液中。骨標本可在4℃條件下儲存過夜。4.次日早晨，用含有100U/ml青霉素和100ug/ml硫酸鏈

從骨骼肌分離和培養單肌纖維的方法步驟2021/11/15

材料與儀器MatrigelDMEML-谷氨酰胺Ⅰ型膠原蛋白青霉素和鏈霉素混合液雞胚提取液馬血清胎牛血清接種培養液增殖培養液Petri培養皿改良Pasteur吸管24孔培養板鉆石筆透照立體解剖顯微鏡步驟1.處死動物后立即切除肌肉。注意夾持肌腱，以減少對肌纖維的損傷。2.將肌肉放入0.2%Ⅰ型膠原蛋白酶液（W/V，用DMEM配制），在35°C條件下用搖動水浴箱孵育60~90min。較大肌肉需要較長消化時間，一般情況下取自6~8周大鼠的趾長伸肌需消化60min。3.準備盛肌纖維的Petri培養皿，即用

從成年骨骼肌分離和培養成肌細胞的方法步驟2021/11/15

材料與儀器D-PBSA轉運培養液生長培養液鏈酶菌蛋白酶液尼龍網手術刀鋒利的長剪刀Petri培養皿培養瓶20ml離心管或一般容器血細胞計數板步驟一、分離1.用手術刀切除活檢組織塊上的非肌性組織，然后用D-PBSA浸洗。2.稱重前，與肌纖維平行將切除活檢組織切成片，用沖洗。3.將組織片平行放入Petri培養皿蓋內，切成較薄的柱狀組織塊，然后切成1mm3小塊。不要擠壓組織。也可在試管內用長剪刀將組織剪成小塊，應避免擠壓組織。4.用D-PBSA浸洗組織塊，靜置后吸去上清液。5.在37°C條件下，用鏈酶菌